人工饲料饲养的对虾肠道菌群和水体细菌区系的研究

cjlittlepig

摘自《热带海洋学报》

摘要: 对人工饲料饲养的凡纳滨对虾成虾肠道菌群组成及其水体细菌区系组成进行了研究。分离纯化后的革兰氏阴性菌鉴定到种的水平。对虾肠道菌群主要由弧菌、希瓦氏菌属、嗜氢菌属、伯克霍尔德氏菌、气单胞菌、食酸菌和芽孢杆菌组成。水体细菌区系主要包括弧菌、希瓦氏菌属、艾肯菌、无色杆菌和芽孢杆菌。肠道菌群和水体细菌区系的优势菌是副溶血弧菌和芽孢杆菌。利用Shannon-Wiener 指数进行多样性分析，发现虾肠道多样性指数(H ) 和均匀度( J ) 高于水体细菌区系，而丰度( D) 较低。

关键词: 虾肠道菌群; 水体细菌区系

cjlittlepig

用微生态学方法来防治病害发生、减少环境污染、增进动物健康是未来水产养殖业的热点。肠道菌群是微生态学中的一个重要组成部分。肠道菌群对其他动物包括鱼虾类的生长、存活有重要的生理意义[1] 。本文使用Biolog[2]方法对凡纳滨对虾成虾肠道细菌区系组成及其水体细菌区系组成进行了研究，目的在于为对虾肠道菌群研究提供一些基础数据。

cjlittlepig

1 材料与方法

1.1试验用虾及饲养管理

凡纳滨对虾虾苗购于中国水产科学研究院南海水产研究所海南开发中心，体重为0.827±0.006g。虾苗置于14 个容积为250L 的水池中养殖，每个水池饲养对虾25 尾。本试验为全封闭式循环养殖系统，养殖水体为砂滤循环人工海水。每天早、中、晚各投喂1 次，饲料为添加了芽孢杆菌制剂的对虾饲料( 中国水产科学研究院南海水产研究所生产) 。试验期间水的盐度为7-11，温度为28-31℃。饲喂56d 后对虾平均体重为7.91±0.75g，成活率为95% ±1%。

1.2肠道细菌分离和计数

虾苗饲养56d 后随机在一个水池中取14 尾，虾表面用75% 酒精消毒，在无菌操作下取出整条肠道，加入事先称重过的已灭菌的玻璃匀浆器中称重。加入少量无菌生理盐水( 0.85% NaCl) 进行匀浆，匀浆后定容至1ml。以匀浆后的样品为原液进行10 倍梯度稀释，取0.1ml 涂布2216E 平板，28 ℃倒置培养2d 后进行活菌计数。分离纯化2216E 平板上的单菌落，菌种保存于- 70℃冰箱中。

1.3水体细菌分离和计数

现场用无菌玻璃瓶采集水样500ml 密封带回实验室，然后取1ml 进行10 倍梯度稀释，取01 1ml 涂布2216E 平板，28 ℃倒置培养2d 后进行活菌计数。随机挑取2216E 平板上各种单菌落划线作进一步纯化。菌种保存于- 70 ℃冰箱中。

1.4 Biolg 方法鉴定分析纯菌株

按照Biolog( ML3 _ 420) 快速鉴定系统操作程序，对纯菌株进行革兰氏染色后将革兰氏阴性细菌按照传统方法[3] 进行氧化酶生化鉴定和三糖铁试验，对其进行分类。革兰氏阳性菌按照Shewan 的海洋异养细菌检索表检索[4]。各类不同的革兰氏阴性菌培养于Biolog 培养基，根据不同的浊度要求制备菌悬液，用多孔加样器接种于96孔GN 微板，每孔150μL，置于合适培养温度下培4h、16h 后观察结果。根据微板纯细菌代谢指纹情况和Biolog数据库相似度以及位距，得出鉴定结果(表1)。相似度在0.500-1.000之间，位距在0-5.00 之间，是比较满意的结果。

1.5 细菌多样性的分析

根据生态学原理，按种的水平分析对虾肠道细菌区系(P) 和水体细菌区系(W) 的多样性，分别用Shannon-Wiener 多样性指数( H ) 、丰度( D) 和均匀度( J ) [4] 表示。计算公式如下:

H = -∑Pi log2 P 1

D = ( S - 1) / log2N

J = H / log2S

式中Pi 为i 种的个数与样品中总个数的比值，S为采样点中样品的总种类数，N 为样品中细菌的总数。

cjlittlepig

2 结 果

2.1 鉴定结果

纯化菌株鉴定结果见表1。从对虾肠道菌群和水体细菌区系中共分离出71 株细菌，其中7 株革兰氏阴性菌因为不在Biolog系统数据库中或者是因为在移种、保种过程中死亡而没有结果。对虾肠道菌群主要由弧菌、希瓦氏菌属、嗜氢菌属、伯克霍尔德氏菌、气单胞菌、食酸菌和芽孢杆菌组成。水体细菌区系主要包括弧菌、希瓦氏菌属、艾肯菌、无色杆菌和芽孢杆菌。

2.2 细菌计数结果以及优势种组成

对虾肠道菌群和水体细菌区系的异养细菌总数以及优势种组成见表2。

2.3 细菌聚类分析

对虾肠道革兰氏阴性菌和水体革兰氏阴性菌在24h 记录的对95种碳源利用的OD 值作为统计标量，利用Biolog系统的Mlclust 程序进行聚类分析。结果表明，对虾肠道菌群与水体细菌区系菌株之间的相似性达到70% 以上，两者优势菌的相似度高达90%以上(图1) 。

2.4 细菌多样性

把未鉴定出来的菌株当成一个类群后，分析了对虾肠道菌群和水体细菌区系的细菌多样性指数(表3) 。

cjlittlepig

3 讨 论

已有研究结果表明，对虾的肠道菌群组成受外部环境影响较大，但弧菌是其肠道常见细菌。Moriaty[ 6] 发现在Penaeus japonicus 的养殖水体和肠道中具有相同的细菌类群。Yasuda 等[7] 报道，在日本对虾的蚤状幼体期弧菌是优势菌属，养殖126d 以后虾池中的优势菌是弧菌，但是在沉积物中假单胞菌是优势菌，而日本对虾的成虾栖息在沉积物中，因此认为在日本对虾成虾消化道中的优势菌是假单胞菌。Dempsey等[8] 报道了在对虾Penaeus aztecus 和Penaeus setiferus 的胃和后肠中分离鉴定出5 类占优势的细菌类群，它们是弧菌、产碱杆菌、气单胞菌、色杆菌和类假单胞菌( 假单胞菌、黄单胞菌和交替单胞菌) 。Wang 等[9]报道了野生健康中国对虾肠道细菌区系优势菌属为弧菌和发光杆菌属。从本实验结果看，虾肠道和养殖水体具有相同的优势菌(表2) ; 从细菌组成看，虾肠道可培养的细菌种类比养殖水体多，对虾肠道中存在部分细菌种类而养殖水体没有(表1) 。这表明对虾肠道菌群与养殖水体有关，也与饲料有关。在外部环境中少量存在的细菌进入对虾肠道后可以大量繁殖。

在养殖环境中微生物主要充当“消费者”的角色，起着分解动植物残体、储存转化养分、降解污染物等作用，从而使得水域环境得到净化; 但有害细菌的增长会导致病害的发生。通常条件致病菌是海水中的常见菌，有可能随海水进入养殖池中。在人工高密度养殖过程中各种人为因素如水处理过程( 化学试剂和UV 处理) 会干扰水体中的正常细菌区系，加上高密度的养殖、死亡动物以及活饵料的投喂造成高负荷的有机环境，促使池中有害细菌大量生长繁殖。弧菌被报道是对虾的条件致病菌[10] 。

从碳源利用量来看，弧菌可以利用的碳源多达44种，一旦虾池环境受到污染，弧菌就能优先利用有机物而进行增殖，若弧菌的增长抑制了其他细菌的生长，整个微生态平衡受到胁迫，生态功能下降甚至丧失，其虾池物质循环受到抑制。同时，当水体中弧菌占据最大优势时对虾肠道中也应该存在大量弧菌，对虾受到弧菌的攻击，生长受到抑制、免疫力低下[11]，再加上外部环境的胁迫就容易发病甚至死亡。可见病害的发生不是特定病原菌引起的，而是环境污染、对虾抵抗力弱、微生态多样性减少的综合结果。本试验中弧菌数量较多并占据优势地位，但是其细菌多样性指数也较高，同时芽孢杆菌的存在可能以某种机制刺激了对虾的免疫机能[12]防御弧菌病原菌的攻击，因此并没有爆发病害。

从碳源利用量来看，对虾肠道细菌在纯培养时具有较大的碳源代谢能力。这可能表明对虾肠道中的细菌区系与高等陆生动物肠道中细菌区系一样参与了机体的消化过程，它们在对虾的肠道中能够以高密度存在，并且在相对短但营养丰富的肠道中具有非常大的消化活性。Wang 等[9] 研究也表明，对虾肠道中某些弧菌很可能具有潜在的助消化能力。

在全封闭式养殖模式下，水体细菌区系相对来说与残饵的关系更为密切。在本研究中，整个对虾肠道中弧菌和芽孢杆菌是优势菌，与水体中的优势菌组成一致。对虾肠道菌群受水体以及饵料的影响较大。弧菌包括对虾条件致病菌，不仅是虾池水体中的正常菌群，还可以在对虾肠道中大量繁殖，可能具有潜在的助消化能力。可以进一步研究从弧菌中筛选有益菌再混合其他有益菌制成一个多功能群的微小区系应用于水产养殖中，利用弧菌的适合虾池环境生长的有利条件来进行微生态调节，化有害为有利，从而达到改善整个养殖生态环境的效果。

cjlittlepig