国内外鱼用病毒疫苗的研究进展

　　

　　中国水产频道独家报道，本文对国内外鱼用病毒疫苗的商品化新动态进行介绍，对国内外各类减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗及DNA疫苗的研究进展进行综述，为我国鱼用病毒疫苗的发展提供一些思路。

　　

　　水产病害的暴发现已成为了渔业发展的瓶颈，鱼用疫苗不仅能有效解决水产病害的发生，还能解决各种药物残留带来的食品安全问题和环境污染问题。病毒病具有侵染性强、致死性高等特点，病毒病近年来在水产病害中的比重越来越重。本文对国内外鱼用病毒疫苗的商品化新动态进行介绍，对国内外各类减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗及DNA疫苗的研究进展进行综述，为我国鱼用病毒疫苗的发展提供一些思路。

　　

　　相对于人用疫苗和兽用疫苗，水产类疫苗的研究起步较晚。1942年，Duff等通过注射和口服方式来免疫硬头鳟，这是世界上出现的第一个商业化的疫苗。20世纪70年代，欧美鲑鱼工业化养殖产生的重大传染性病害促进了欧美各国积极开发推广鱼用疫苗，以减少抗生素的运用。自1976年鱼类疫苗第一次在美国获准生产开始，全球商业化的鱼用疫苗已达140种。我国鱼用疫苗研究相对滞后，早期的草鱼出血病组织浆灭活疫苗正式开启了我国鱼用疫苗研制的历史，2011年3月，草鱼出血病活疫苗（兽药生字（2011）190986021）的生产和使用，推动着我国水产疫苗的产业化进程。据不完全统计，我国主要针对鱼用疫苗27种病原的相关研究，涉及10种病毒类病原。病毒病具有传染性强、致死性高、侵染动物体后在宿主内复制，抗生素对其作用小等特点，严重危害鱼类养殖业，一旦暴发病毒病将引起鱼类大规模的死亡，因此开发鱼用病毒疫苗势在必行。

　　

　　一、商业化鱼用病毒疫苗

　　迄今为止已报道可引起鱼用病毒病的病原有上百种，常见的有虹彩病毒属（流行性造血器官坏死症病毒、传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒、淋巴囊肿病毒）、疱疹病毒科（锦鲤疱疹病毒、斑点叉尾鮰病毒、鲤鱼痘疮病毒鲑鱼疱疹病毒、马苏大马哈鱼病毒）、弹状病毒科（鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死病病毒、行动性出血败血症病毒、鳜弹状病毒）、呼肠孤病毒（草鱼呼肠孤病毒）、双节段RNA病毒(传染性胰腺坏死症病毒)、野田病毒科（病毒性神经坏死病毒）和正黏病毒科（传染性鲑鱼贫血症病毒）。

　　

　　现就全球已经商业化的鱼用病毒疫苗的使用情况做一概述，主要以国外鲑鱼为代表的鱼类疫苗为主，详见下表1。

　　

　　

　　二、疫苗的类型

　　

　　鱼类病毒疫苗按照制备方式分为减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗及DNA疫苗。

　　

　　1、减毒活疫苗

　　

　　减毒活疫苗是一类将经特殊的培养方法获得毒力减弱或无致病力但具有免疫原性的毒株制备的疫苗。减毒活疫苗可以在宿主体内繁殖经体液免疫刺激机体产生抗体，同时通过细胞免疫抵抗病毒的入侵，对机体的免疫系统一直都有免疫刺激作用。

　　

　　Fryer等从虹鳟鱼分离出的IHNV病毒株接种STE-137细胞，传代41代后减毒100倍成为减毒毒株，可以作为减毒疫苗候选毒株。不过后续试验证明该减毒疫苗对虹鳟鱼依然有毒性。Eléouët JF等也证实用经细胞驯化后无致病性的IPNV分离毒株对鲑鱼没有免疫效果。吴淑勤等研制的草鱼出血热弱毒疫苗免疫效果良好，是中国第一个获得新兽药证书的鱼用弱毒疫苗。

　　

　　减毒活疫苗的免疫效果好，免疫剂量小，并且不需要添加佐剂。但其不足之处在于可能出现毒株返强的现象、安全性差，并且由此导致在环境中失去控制等，这限制活疫苗的应用推广。

　　

　　2、灭活疫苗

　　灭活疫苗是指将病原体通过细胞培养技术放大培养后，利用化学方法将病原体灭活制备而成的疫苗。该疫苗依然保留了病原体的免疫原性，安全性评价较好，制备过程较为成熟，但是免疫持续期较短，需要重复接种，并且需要添加一定的佐剂以增强免疫效果。

　　

　　研究表明用0.2%的福尔马林在4℃灭活72h灭活制备IHNV灭活疫苗对虹鳟鱼有很好的免疫效果，而且免疫效果从免疫后7d持续70d。Nakajima等用福尔马林灭活的RSBIV疫苗能有效控制虹彩病毒病。RSBIV灭活疫苗现已在日本投入上市，成为了首个预防海水鱼的病毒疫苗，主要宿主为真鲷鱼、鰤鱼属和拟鲹鱼。台湾针对台湾石斑鱼虹彩病毒病研制了新的灭活疫苗，大陆针对ISKNV、RSIV的灭活疫苗现也进入了临床阶段。菲律宾的RGNNV灭活疫苗用于免疫褐点石斑鱼，同时对其他海水鱼类的NNV有很好的交叉免疫效果。

　　

　　总的来说，通过一定剂量及反复的免疫，灭活疫苗对宿主有很好的免疫保护作用。智利、加拿大、美国及欧洲一些饲养高经济价值的鱼类的国家已经把接种灭活疫苗作为预防传染性病害的重要方法，同时要求制药企业获得疫苗生产许可后才可以生产鱼类病毒灭活疫苗，只有这样灭活疫苗的生产使用才会更加规范。

　　

　　3、亚单位疫苗

　　

　　亚单位疫苗是除去病原中与免疫反应无关的成分，而保留有效免疫原成分制成的疫苗。亚单位疫苗要求对病毒的免疫保护基因的核酸序列及氨基酸序列有很好的前期研究，并找到编码特定抗原基因的基因序列并进行克隆及表达。亚单位疫苗具有无传染性、低成本大规模生产、生产技术相对单一，提高体液免疫等特点。

　　

　　Gilmore等利用大肠杆菌首次表达传染性造血组织坏死病毒G蛋白来增强虹鳟鱼免疫力。用不同剂量及注射频率注射大肠杆菌表达的NNV的病毒样颗粒可用于预防GNNV，免疫4周后血清中抗体依然可以中和活病毒。用杆状病毒表达IHNV和VHSV的G蛋白能够刺激体液免疫、具有比原核表达更大的表达量，同时解决了原核表达的G蛋白由于没有糖基化免疫效果不稳定的问题，因此可以用作亚单位疫苗的候选。由IPNV的VP2和VP3组成的病毒样颗粒（VLPs）包含有病毒结构抗原表位、具有淋巴细胞和分泌抗IPNV抗体的强大增殖能力，IPNV的病毒样颗粒可以用于制备IPNV亚单位疫苗。用杆状病毒表达的NNV病毒样颗粒对欧洲鲈鱼有很好的免疫保护效果。大肠杆菌表达诺达病毒主衣壳重组蛋白recCP对大西洋比目鱼的免疫保护效果显著，可以用于作为预防诺达病毒的亚单位疫苗。

　　

　　用微量免疫中和法证实大肠杆菌表达GCRV的VP5亚单位疫苗免疫草鱼可以预防GCRV，ELISA方法也证实口服GCRV的VP5亚单位疫苗的保护率高达90%以上。

　　

　　4、合成肽疫苗

　　

　　用单克隆抗体中和蛋白的抗原表位的使用让合成肽作为疫苗成为可能。一旦鱼的T细胞和B细胞的抗原表位被识别，运用合成肽技术生产合成肽疫苗变为现实，并且具有质量稳定、没有传染性和易于生产等特点。合成肽疫苗的投入使用，必须建立在鱼体对不同抗原免疫应答的机制深入研究，关键在于确定抗原决定簇中能促使机体产生免疫应答成分的氨基酸序列。Fridholm等证明原核表达的VP2蛋白与从病毒中分离纯化的VP2蛋白利用兔子模型来在体外进行中和病毒实验，两者引起相同的免疫反应。

　　

　　5、DNA疫苗

　　

　　DNA疫苗又称为基因疫苗或者核酸疫苗，是将编码病原的抗原基因插入环状的真核表达DNA载体中，经接种被宿主细胞摄取，从而转录表达出病原的抗原蛋白，刺激机体产生应答反应。鱼类DNA疫苗通过肌肉注射进入鱼体内被鱼的肌肉细胞和单核细胞摄取，表达产生的抗原蛋白在肌肉细胞的MHC I或者抗原提呈细胞（APCs）的MHC I和MHC II的作用下修饰成内生源的抗原。1990年Wolff等首次提出后，DNA疫苗得到发展迅速，将引领未来疫苗的革命性发展，因此被称为“第三代疫苗”。

　　

　　由于缺乏有效的病毒疫苗及灭活疫苗生产成本居高不下等方面的因素，DNA疫苗是以后鱼类病毒病疫苗的发展趋势。1996年，首次报道了IHNV DNA疫苗的应用，通过使用含有IHNV G蛋白基因的质粒免疫虹鳟鱼可以有效地预防IHNV。2005年，IHNV的DNA疫苗在加拿大获得新兽药注册并广泛推广应用。用VHSV病毒G蛋白构建的DNA疫苗能够诱导70%的虹鳟产生较高水平的免疫保护性。目前这两种DNA疫苗已经广泛的应用。de Las Heras AI等对IPNV的VP2基因进行藻酸盐微球进行包装成DNA疫苗，这一首次运用在大马哈鱼的DNA疫苗促使80%的大马哈鱼产生较高的免疫效果，同时一定程度地减少病毒的包装及运输。Zhang等通过构建pCN86的DNA疫苗对大菱鲆进行免疫，发现免疫后的大菱鲆对抵抗RBIC-C1有很好的效果，因此能够广泛地用于预防虹彩病毒肿大细胞病毒病。

　　

　　尽管DNA疫苗的科学性得到验证，但其发展过程仍面临规范化等一系列的问题。美国食品药品监督局FDA、欧洲药品监督局EMA和世界卫生组织WHO都陆续地颁布相关DNA疫苗的指导意见，主要强调染色体整合外源DNA、DNA耐受能力和DNA疫苗是否会诱导自身免疫疾病等方面的相关问题。国际上对是否认定免疫DNA疫苗的动物为转基因生物存在不同标准，因此有必要统一。若免疫DNA疫苗的鱼被认为是转基因生物，则必须对其进行标识，这将直接影响消费者的消费意愿。由于不确定DNA疫苗在鱼体内以及环境中的影响，欧洲当局对于如何标识DNA疫苗免疫过的动物仍存在争议。

　　

　　三、讨论

　　

　　鱼用疫苗的研发生产需要有完善生产线和GMP规程，鱼用疫苗的申报审查非常严格，疫苗的申报均参照兽用疫苗申报标准，目前还无关于水产疫苗应用的管理规范，造成了鱼用疫苗研究研发推广相对滞后。

　　

　　目前鱼用病毒疫苗的研发存在巨大的困难的原因有以下几个方面：鱼用病毒疫苗的理论基础薄弱，鱼类免疫学及免疫系统机制、病毒的功能基因特别是抗原基因等研究和疫苗对机体的影响等基础理论研究不够；商业化鱼用病毒疫苗的种类有限（绝大部分都是针对工业化程度非常高的鲑鱼），鱼用疫苗的相关知识普及率不够，渔民对鱼用疫苗的认可程度不高等。

　　

　　在2016年全国渔业渔政工作会议上，农业部部长韩长赋部长“加快转方式调结构，促进渔业转型升级”的讲话为以后鱼类疫苗的审批申报推广甚至是渔业的转型发展提供了重要的指导依据，促进鱼用疫苗的稳步发展。

　　

　　凭借着扎实的理论研究基础，人、兽用疫苗为人类征服恶性疾病及动物养殖事业提供有效途径，因此可以借鉴人、兽用疫苗的研究思路，加快推进鱼用疫苗防治水产病害的进程。通过开展病毒感染与致病相关功能基因的研究，从而阐明病毒感染与疫病暴发的细胞分子机理、病毒遗传变异与感染宿主的免疫；分析病原侵染与环境变化对免疫相关基因表达，揭示宿主对病原侵染的应答规律；研发有效的疫苗导入途径，剖析疫病防治的免疫学关键技术途径，分析疫苗的免疫效果与宿主环境的关系，确定疫苗有效评价体系，开发出适用大力推广的鱼用疫苗，在此基础上推出多价苗及偶联苗，从而大大减少水产养殖业中病毒病的危害及药物使用，确保产品质量的同时根本缓解水产养殖造成的环境污染，促进水产业的蓬勃发展。

　　

　　（参考文献略）